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　　[0002]自然杀伤细胞(natural killer cell, NK)是机体重要的免疫细胞,不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生，其发育成熟依赖于骨髓和胸腺微环境。NK细胞的功能主要是通过一下方式实现的。NK细胞自然杀伤活性:NK细胞识别靶细胞(某些肿瘤细胞、病毒感染细胞、某些自身组织细胞、寄生虫等)，接着NK细胞释放穿孔素，细胞毒因子，活化的NK细胞释放TNF因子，从而达到裂解和杀伤靶细胞的可能。NK细胞毒作用(ADCC效应)，主要是NK细胞表面具有FcyR III A，主要结合人IgGl和IgG3的Fe段(C Y 2、C Y 3功能区)，在针对靶细胞特异性IgG抗体的介导下可杀伤相应靶细胞。活化的NK细胞可合成和分泌多种细胞因子，发挥调节免疫和造血作用以及直接杀伤靶细胞的作用。NK细胞通过自然杀伤和ADCC发挥的细胞毒作用，在机体抗病毒感染、免疫监视中起重要作用。

　　[0006]为实现上述目的，在本发明的第一个方面，本发明提供了一种用于检测NK细胞活性的方法，包括步骤:(I)首先制备细胞:取3ml肝素钠抗凝的外周血与PBS缓冲液按照1:1稀释，将稀释后的标本缓慢注入具有2ml淋巴细胞分离液的1ml离心管中，以665g转速离心20min，吸取中间白细胞层；采用PBS清洗2次，然后以393g转速离心lOmin，去上清液；将500μ I RPMI1640培养液加入离心得到的沉淀中，混匀，得到单个核细胞(PBMNC)，浓度调节为l*106/ml备用；取对数期的K562-EGFP细胞用PBS洗2次，然后以393g转速离心1011^11，去上清液，加50(^1 RPMI1640培养液混匀，放室温静置lh，浓度调节为l*105/ml备用；(2)将 100 μ I K562-EGFP 加入 I 号管(对照管)中；将 100 μ I PBMNC+100 μ I K562-EGFP加入2号管(检测管)中；然后将I号管与2号管均放入5% C02培养箱中孵育2h ； (3)将5.520 μ I抗体7-AAD-percp-cy5.5加入I号管与2号管中，充分混匀，静置I分钟，然后采用流式细胞仪检测细胞活性。

　　[0019]NK细胞中含有大量的酶，当机体遇到靶细胞时，NK细胞能快速识别，并合成与分泌大量的细胞因子、酶、穿孔素等活性物质来裂解和杀伤靶细胞。本发明基于以上理论设EGFP-K562/PBMNC/7-AAD-percp-cy5.5 组合检测方法，7_AAD-percp-cy5.5 能让杀伤的靶细胞着色，利用CantoII检测被杀死的靶细胞。原理是用转染EGFP的K562细胞与BPMC按照1:10的比例在5% C02培养箱中孵育2h后，在加入7-AAD-percp-cy5.5，充分混匀，稍置片刻上机检测，单细胞悬液在鞘液的包裹下形成单细胞液流并流经检测窗口 ；仪器产生的激光会激发抗体上标记的荧光素从而发出特定波长的光；仪器对不同波长的光进行分别检测，并转换成电信号；电信号经计算机系统处理后可进行分析。

　　1.一种用于检测NK细胞活性的方法，包括步骤: (1)取3ml肝素钠抗凝的外周血与PBS缓冲液按照1:1稀释，将稀释后的标本缓慢注入具有2ml淋巴细胞分离液的1ml离心管中，以665g转速离心20min，吸取中间白细胞层；采用PBS清洗2次，然后以393g转速离心lOmin，去上清液；将500 μ I RPMI1640培养液加入离心得到的沉淀中，混匀，得到单个核细胞PBMNC，浓度调节为l*106/ml备用； 取对数期的K562-EGFP细胞用PBS洗2次，然后以393g转速离心lOmin，去上清液，力口500 μ I RPMI1640培养液混匀，放室温静置lh，浓度调节为l*105/ml备用；