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　　产品中文说明书 NK细胞无血清培养试剂盒II 产品货号：HUXNK-9006B 产品描述 Cyagen-NK细胞无血清培养试剂盒II是一款为NK细胞高效扩增专门研发的试剂 盒，具有增殖特性好且NK细胞表型比例高的特性。试剂盒II 由NK细胞无血清培养 基、NK细胞激活抗体、白细胞介素-2 、缓冲液构成培养体系。该培养体系化学成分 明确，培养过程中仅需添加少量自体血清（血浆），为NK细胞扩增提供一个营养成 分完全且平衡的体外环境。扩增体系采用药物级抗体诱导T 细胞凋亡并特异性激活 NK细胞增殖，同时增强NK细胞杀伤活性。 Cyagen-NK细胞无血清培养试剂盒II包含转铁蛋白、人重组胰岛素、重组人血清 白蛋白等蛋白成分，不含任何外源性生长因子及不明确的添加成分，生产过程符合 cGMP标准规范，严格按照ISO9001 国际质量管理体系对产品质量进行控制，产品通 过微生物（细菌、真菌及支原体等）、内毒素、pH和渗透压等临床级严格检测。 试剂盒成分 NK cell-activating serum free medium 200 mL NK 细胞激活无血清培养基（货号：HUXNK-02061 ） NK cell-expanding serum free medium 1000 mL×2 NK 细胞扩增无血清培养基（货号：HUXNK-02062 ） Interleukin-2 (IL-2) 200 μg×2 白细胞介素-2 （货号：HEILP-0201c ） NKAC-Antibody 1.5 mL NK 细胞激活抗体 （货号：HUXNK-9101B ） NK cell-activating factor 100 μL NK 细胞激活因子（货号：HUXNK-9103B ） Buffer 50 mL 缓冲液 安全信息  不含外源生长因子、人造细胞增殖刺激因子或不明成分的添加剂。 CBPI0491A6 HUXNK-9006B Page 1 of 6  不含蛋白激酶C刺激因子，尤其适用于研究活化的人和鼠淋巴细胞第二信号系 统。  本产品仅用于科学研究。 使用说明 以下过程作为常规NK 细胞培养的一般准则，如需在生物反应器或培养袋高密度 培养，应优化条件来确定最佳的操作步骤。 实验应在局部百级洁净环境（如生物安全柜）中进行。 1 Interleukin-2 (IL-2)生物活性及复溶方法 1.1 生物活性 与标注品生物活性一致。用小鼠CTLL-2细胞依赖法测定生物活性。ED50小于0.1 7 ng/mL ，对应的比活性为≥1×10 IU/mg 。 1.2 复溶方法 1) 在打开使用前，请使用离心机短暂离心，以保证管子内的所有内容物到达管壁底 部后再进行溶解。 2) 用Buffer溶解到工作所需浓度（溶解后的蛋白浓度控制在0.1~ 1.0 mg/mL），溶解 过程中请勿漩涡振荡。 3) 储藏时应根据每次实验需要的量分装于不同的小管内，置于-20°C保存，避免反 复冻融。 2 抗体包被 1) 将1.5 mLNK细胞激活抗体加入6 mL Buffer 中充分混匀后将7.5 mL包被液全部转入 T75培养瓶，轻摇铺满整个瓶底。 注意： (1) 包被液需充分混匀且一定要均匀铺满整个 T75 培养瓶底，避免由于抗体包被不均匀， CBPI0491A6 HUXNK-9006B Page 2 of 6 影响激活效果。 (2) 不同容器包被面积的抗体使用量参考如下： 孔板/培养瓶 抗体用量 Buffer 用量 6 孔板 0.25 mL 1 mL T25 培养瓶 0.5 mL 2 mL T75 培养瓶 1.5 mL 6 mL 2) 抗体4°C包被过夜，建议包被12~18 h。培养瓶尽量水平放置，瓶口外可用封口膜 缠绕后避光保存。 3) 包被好的培养瓶如果当天不使用，放置在4°C冰箱中保存，为避免抗体活性下降， 建议尽快使用。 4) 使用前吸出包被液，用7 mL Buffer洗涤一次包被瓶。 注意： 添加 Buffer 洗涤包被瓶时，需把培养瓶竖起，从瓶底缓缓加入液体，不要吹打包被， 以免吹打对结合在瓶上的抗体造成损失，然后将培养瓶轻轻放倒，静置 2 min 后轻轻晃 动包被瓶对未结合到瓶底的抗体进行洗脱，将洗涤液吸出。 3 抗体特异性激活NK细胞: 1) 提前配置含2000 IU/mL IL-2 的NK 细胞激活完全培养基，并预热至37°C 备用。 2) 准备新鲜的外周血单个核细胞(PBMC) ；或根据细胞解冻程序，37°C 的水浴中 快速复苏(1 min) PBMC 。 注意： 建议采用新鲜分离的PBMC扩增NK细胞。PBMC经冻存后，可能会导致PBMC中细 - + + + 胞组份发生变化，NK细胞膜结构发生改变，降低CD3 CD56 、CD16 、CD56 、 NKG2D+ 比例。 3) 用生理盐水或者pH7.2 左右的磷酸缓冲液洗涤细胞。 4) 细胞计数。 CBPI0491A6 HUXNK-9006B Page 3 of 6 5) 离心细胞（350×g 离心5 min ），去除上清。 6) 用新鲜配制的含2000 IU/mL IL-2 的NK 细胞激活完全培养基重悬PBMC ，并按容 积比10%左右的浓度加入热灭活的人自体血浆；按照1mL 培养基添加2.5 μL 的 6 比例添加NK 细胞激活因子。建议细胞密度控制在1~2×10 cells/mL，转移细胞到 相应的细胞培养容器（培养袋、培养瓶），放入37°C，5% CO2 的细胞培养箱中 培养。 注意： (1) 建议将自体血浆56℃热灭活30 min 后，离心使用。经过热处理的血浆，沉淀物会显 著增多，镜下观察沉淀像是“小黑点”，这是血浆灭活后的正常现象，可放心使用。 (2) 血浆存放于4°C 时，请勿超过一个月。 (3) 也可直接使用商品化的病毒灭活血浆。 (4) 对于较难采取的血样可以按照1×106 cells/mL 密度起始，以获得较高的增殖倍数。 T25 培养瓶，细胞接入体积建议4 mL 左右起始，T75 培养瓶，细胞接入体积建议 10~20 mL 起始。 7) 第3~4 天，根据细胞密度或培养基颜色适当补加新鲜配制的含2000 IU/mL IL-2 的NK 细胞激活完全培养基。 注意： NK 细胞对温度较为敏感，低于36.5°C 会影响NK 细胞的激活。细胞培养前3 天， 尽量不要去观察细胞状态，减少在培养箱外的滞留时间。每次补液前需将培养基于37°C 水浴锅内充分预热。 8) 第5 天，350×g 离心5min 去掉抗体和激活因子，用含2000 IU/mL IL-2 的NK 细 胞激活完全培养基重悬，按照最终容积比6%左右添加热灭活的人自体血浆。 注意： 建议使用悬浮细胞专用培养板、培养瓶或培养袋，以减少转瓶/袋时细胞的损失。 4 定向扩增NK细胞 第 7~21 天期间，每 2~3 天，仔细观察细胞生长状态并计数，根据细胞密度或培 养基颜色补加新鲜配制的含1000 IU/mL IL-2 的NK 细胞扩增完全培养基，并控制细胞 CBPI0491A6 HUXNK-9006B Page 4 of 6 6 浓度在1×10 cells/mL 以下。 从第7 天开始，不需要额外再添加血清（血浆）。 在对数生长期细胞，需要维持细胞所需的浓度。为了保持细胞处于指数生长，当 6 6 细胞密度超过 1×10 cells/mL 时，需要分离传代，维持细胞密度在0.8~1×10 cells/mL。 在静态平板培养中为了获得最佳的气体交换，建议培养基深度不宜超过1~1.2 cm。 产品稳定性及保存条件 1 所有产品均需避光保存。 2 保存条件和有效期 试剂名称 保存条件 有效期 NK 细胞激活无血清培养基 2-8℃ 1 年 NK 细胞扩增无血清培养基 2-8℃ 1 年 白介素-2 -20 至-80℃ 1 年 NK 细胞激活抗体 2 至8℃ 1 年 NK 细胞激活因子 -20 至-80℃ 6 个月 缓冲液 常温 1 年 3 Interleukin-2 (IL-2)冻干制品在2~8°C是稳定的，但置于-20 ℃保质期更长。使用时 用Buffer溶解，可在2~8°C稳定至少一周时间，为了达到更长的保质期，建议溶解 后按每次实验的工作体积分装于不同的小管，置-20到-80°C保存。 4 配置成完全培养基后，避光保存在2 ~8°C 可存放2 周。 5 培养瓶包被后，如果当天不使用，放置在4°C 冰箱中保存。为避